Kolorimetrijas un kolorimetrijas metode ar ELISA metodi

(1) krāsu atveidošana

Hromogēna ELISA ir pēdējais inkubācijas reakcijas posms. Šajā laikā enzīms katalizēja bezkrāsainu substrātu, lai iegūtu krāsainus produktus. Reakcijas temperatūra un laiks joprojām ir faktori, kas ietekmē krāsas attīstību. Noteiktā laika posmā negatīvā caurums var palikt bezkrāsains, bet pozitīvais - ar laika pagarinājumu un krāsas uzlabošanu. Atbilstoša temperatūras paaugstināšana ir noderīga, lai paātrinātu krāsu attīstību. Kvantitatīvi nosakot, reakcijas temperatūrai un laikam pēc substrāta pievienošanas jābūt precīzai saskaņā ar noteikumiem. Kvalitatīvi noteiktu krāsu var veikt istabas temperatūrā, laiks parasti nav stingri jākontrolē, dažreiz atbilstoši pozitīvās kontroles akas un negatīvās kontroles akas krāsu situācijai var būt piemērota reakcijas laika saīsināšana vai pagarināšana, savlaicīga spriešana.

Pēc 20-30 minūtēm reakcijas āra temperatūrā vai 37 ℃ OPD substrāta krāsas attīstība parasti netiek padziļināta, un pēc tam reakcijas laiku var pagarināt, lai palielinātu fona vērtību. OPD substrāta šķidrums, mainot gaismu, automātiski mainīs krāsu. Krāsu reakcija jāveic tumsā. Kad krāsu reakcija ir beigusies, reakcijas pārtraukšanai pievieno beigu šķīdumu. Pēc OPD produkta izbeigšanas ar sērskābi krāsa mainās no oranži dzeltenas līdz brūnai dzeltenai.

TMB gaisma neietekmē, un to var novietot uz operāciju galda istabas temperatūrā, lai novērotu rezultātus ar blakus reakciju. Tomēr, lai nodrošinātu eksperimenta rezultātu stabilitāti, ieteicams tos izlasīt attiecīgajā laikā. Pēc HRP apstrādes TMB krāsa sasniedza apmēram 40 minūtes, pēc tam pakāpeniski vājinājās un pēc 2 stundām pilnībā izbalēja līdz bezkrāsainai. TMB beidzas ar dažādiem risinājumiem. Enzīmu inhibitori, piemēram, nātrija azīds un nātrija dodecilsulfāts (SDS), var pārtraukt reakciju. Šāda veida terminators var arī padarīt zilo krāsu saglabātu ilgu laiku (12-24 stundas), ir labs terminators vizuālai spriešanai. Turklāt dažādi skābie terminatori mainīs zilo uz dzelteno, kad absorbcijas vērtības nolasīšanai var izmantot konkrēto viļņa garumu (450 nm).

(2) kolorimetrisks

Pirms kolorimetrijas jāizmanto tīrs absorbējošs papīrs, lai nožūtu šķidru, kas piestiprināts plāksnes apakšpusē, un pēc tam plāksne pareizi jānovieto fermenta standarta kolorimetra kolorimetriskajā rāmī. Pārbaudē ar mīksto plāksni kā nesēju plāksne pirms krāsu salīdzināšanas jāievieto standarta 96 bedrīšu rāmī. Pirms krāsas pamatnes šķīduma pievienošanas mīkstās plāksnes malu notīriet tīru, lai plāksni varētu pilnībā ievietot sēdekļa rāmī.

Veicot kolorimetriju, nulles punkts vispirms jāpielāgo ar destilētu ūdeni, un substrāta caurums (caurums ar substrāta šķīdumu pievienots bez jebkādas reakcijas) un tukšā caurums (caurums ar parasto fizioloģisko šķīdumu vai atšķaidītāju, nevis paraugu kā visu procesu). būtu jāmēra un jālasa, lai reģistrētu šī testa reaģenta stāvokli. Pēc tam var izmantot tukšās caurumus, lai kalibrētu nulles punktu ar destilētu ūdeni, un iepriekšminēto atveru absorbcija jāatskaita no tukšo atveru absorbcijas un pēc tam jāaprēķina.

Kolorimetriskā rezultāta izteiksme ir opliskais blīvums (OD) agrāk, bet absorbcija (A) tiek izmantota saskaņā ar noteikumiem, kuriem ir vienāda nozīme. Parastā izteiksmes metode ir absorbcijas viļņa garuma ierakstīšana burta A apakšējā labajā stūrī. Piemēram, OPD absorbcijas viļņa garums ir 492 nm, un izteiksmes metode ir" A492nm" vai" OD492nm" ;.

(3) fermenta standarta kolorimetrs

Fermenta standarta kolorimetru sauc par fermenta standarta instrumentu, parasti tas attiecas uz fotometru ELISA rezultātu absorbcijas mērīšanai. Saskaņā ar cietā nesēja dažādajām formām plāksnēm, lodītēm un mazām mēģenēm ir speciāli izstrādājumi. Daudzi reaģentu uzņēmumi nodrošina atbilstošu enzīmu etiķetes instrumentu. Fermenta plāksnes instrumenta galvenie darbības rādītāji ir: lasīšanas ātrums, lasīšanas precizitāte, atkārtojamība, pakāpe un izmērāms diapazons, linearitāte un tā tālāk. Laba mikroplates mērītāja rādījums parasti ir 0,001, ar precizitāti ± 1% un atkārtojamību līdz 0,5%. Piemēram, ja A cauruma A vērtība ir 1,083, tad cauruma patiesajai A vērtībai attiecībā pret gaisu jābūt 1,083 ± 0,01 (1,073 ~ 1,093). Atkārtojot mērījumus vairākas reizes, A vērtībai jābūt 1,083 ± 0,05 (1,078 ~ 1,088). Fermentu plākšņu analizatora mērījumu diapazons mainās atkarībā no fermentu plākšņu analizatora veiktspējas. Parastā enzīmu plākšņu analizatora robeža ir 0,000 ~ 2,000, bet jaunā enzīmu plākšņu analizatora robeža tiek paplašināta līdz 2,900 vai pat augstāka. Vērtību, kas pārsniedz mērījuma augšējo robežu, bieži norāda" *" vai" virs" vai citi simboli. Jāpievērš uzmanība starpībai starp izmērāmo un lineāro diapazonu. Lineārais diapazons bieži ir mazāks par izmērāmo diapazonu. Piemēram, noteikta enzīma plāksnes instrumenta izmērāmais diapazons ir 0,000 ~ 2,900, savukārt tā lineārais diapazons ir tikai 0,000 ~ 2,000, kam jāpievērš uzmanība, veicot standarta līkni kvantitatīvajā ELISA.

Fermenta etiķetes instrumentu nedrīkst novietot zem saules gaismas vai spēcīgas gaismas apstarošanas. Darbības laikā istabas temperatūrai jābūt 15 ~ 30 ℃. Instruments pirms lietošanas ir jāsasilda 15 līdz 30 minūtes, lai lasīšanas rezultāti būtu stabilāki.

Mērot A vērtību, jāizvēlas produkta jutīgā absorbcijas pīķa. Piemēram, OPD izmanto 492 nm viļņa garumu. Pirmais laiks ir optimālā viļņa garumā (W1), bet otrais - nejutīgajā viļņa garumā (W2). ELISA plāksnes pozīcija netiek pārvietota starp diviem mērījumiem. Piemēram, OPD izmanto 492nm kā W1 un 630nm kā W2, un galīgā izmērītā A vērtība ir starpība starp abiem (W1-W2). Divkārša viļņa garuma nolasīšana var samazināt gaismas traucējumus, ko rada skrāpējumi vai pirkstu pēdas uz konteinera.